Developing a CRISPR-based Toolkit to Study Precise Dosage Modulation of Gene Expression

Sammanfattning

Komplexa sjukdomar såsom cancer, diabetes samt kardiovaskulära och neurologiska sjukdomar uppstår inte från enskilda genetiska mutationer, utan från den samlade effekten av många genvarianter, där varje variant bidrar med en måttlig förändring i genreglering. För att förstå hur dessa varianter driver sjukdom krävs kunskap inte bara om vilka gener som påverkas, utan även om hur mycket deras uttryck måste förändras för att ge upphov till nedströms effekter. Majoriteten av sjukdomsassocierade varianter finns i icke-kodande regulatoriska regioner, där de verkar genom att kvantitativt förändra genuttryck snarare än att direkt störa proteinfunktion. För att på ett korrekt sätt modellera sådan regulatorisk variation krävs därför experimentella verktyg som kan generera definierade, mellanliggande uttrycksnivåer som är nödvändiga för funktionella studier. I detta arbete karakteriserar vi två inducerbara CRISPR-baserade perturbationsplattformar i humana hematopoetiska K562-celler: ett dubbelinducerbart CRISPRi-system som använder en dCas9–KRAB–DHFR–TetON-arkitektur kontrollerad av doxycyklin (Dox) och trimetoprim (TMP), samt ett enkelinducerbart CRISPRa-system som använder en dCas9–VPR–TetON-arkitektur kontrollerad enbart av Dox. Det komplementreglerande ytproteinet CD46 användes som det primära kvantitativa målet, vilket möjliggjorde analys på både transkript- och proteinnivå, medan GFI1B, en central regulator av hematopoes, studerades på transkriptnivå för att demonstrera en potentiell utvidgning av dessa plattformar mot utvärdering av nedströms transkriptionella effekter. CRISPRi-medierad repression av CD46 uppnåddes över ett brett intervall av Dox- och TMP-koncentrationer, där de två inducerarna fungerade som oberoende, ortogonala titreringsaxlar. Fyrparametrisk logistisk modellering av de resulterande dos–responsdata gav kalibrerade koncentrationsestimat för att uppnå definierade repressionsnivåer. Detta etablerar ett kvantitativt doseringsramverk som möjliggör precis selektion av inducerkoncentrationer för att återskapa specifika mellanliggande uttrycksnivåer för funktionella studier. CRISPRa-medierad aktivering av CD46 kunde detekteras på encellsnivå med flödescytometri i celler som bibehöll dCas9-kopplat reporteruttryck. Däremot försvårades bulk-qPCR-mätningar av en progressiv förlust av den reporterpositiva cellpopulationen under Dox-induktion, vilket sannolikt återspeglar tystning eller en selektiv nackdel för den viralt integrerade aktiveringskonstruktionen under förhållanden med stark målgeninduktion. Sammantaget visar dessa resultat att det dubbelinducerbara CRISPRi-systemet möjliggör precis, graderad och kvantitativt modellerbar genrepression som är väl lämpad för uttrycksdoseringsexperiment, medan CRISPRa-systemet i sin nuvarande form kräver encellsupplösning för att på ett tillförlitligt sätt kunna skilja verklig målgenaktivering från konstruktförlust på populationsnivå. Framtida arbete kan prioritera TMP-baserade induktionsstrategier, resistensbaserad selektion av effektoruttryckande celler, tidsserieanalys, utveckling av ett dubbelinducerbart CRISPRa-system samt utvidgning av doseringsramverket mot genomskaliga perturbationsscreeningar med encells-transkriptomiska avläsningar eller selektion.