Development of a Flexible Platform for High-Throughput Characterization and Optimization of Protein Biosensors

Sammanfattning

Proteinbiosensorer har visat sig vara värdefulla verktyg inom biotekniken, eftersom de erbjuder effektiv detektering och differentiering av olika kemiska strukturer. Införandet av receptordomäner är en av de banbrytande metoderna för konstruktion av proteinswitchar. Trots deras potential är utvecklingen av robusta och mångsidiga biosensorer fortfarande en utmaning på grund av prestandabegränsningar och de komplexa processer som ingår i konstruktionen av receptor-transducersystem, särskilt för småmolekylära ligander som är svåra att screena för i konventionella displaysystem. Detta projekt lade grunden för en högkapacitetsplattform som syftar till att karakterisera och optimera β-laktamas (BLA)-baserade biosensorer och demonstrera dess mångsidighet och flexibilitet med en fokuserad uppsättning biosensorer för sällsynta jordartsmetaller (REE) och andra småmolekylära ligander. Plattformen integrerar både in vivo- och in vitro-metoder för proteinproduktion och enzymatiska analyser, vilket effektiviserar identifieringen och förfiningen av högpresterande biosensorvarianter. Vi konstruerade ett litet men ändå omfattande bibliotek av chimärer där lantan, ett REE, fungerar som en positiv effektor av BLAs hydrolyserande aktivitet. Genom att utnyttja BLA:s förmåga att ge E. coli antibiotikaresistens utvecklade vi ett system som möjliggör positivt urval av biosensorvarianter på medier som innehåller ampicillin och respektive REE-ligand. Denna effektorberoende resistens-/mottaglighetsfenotyp möjliggör snabb identifiering av biosensorer som aktiveras av REE från ett potentiellt stort genvariantbibliotek. Avgörande för plattformens framgång var att uppnå en balans mellan effektiv överlevnadsscreening, effektiv proteinproduktion och direkta enzymatiska analyser. Screening av cellkulturer och supernatanter för BLA-aktivitet i närvaro eller frånvaro av målliganden med hjälp av ett kromogent β-laktamsubstrat möjliggjorde kvalitativ jämförelse av sensorprestanda i olika medier, vilket återspeglar sensorspecificitet för olika analyter. För att ytterligare förbättra kvaliteten på dessa data presenterar vi en idé för normalisering av uttrycksnivåer av His-märkt protein mellan prover. In vitro-pipelinen kringgår beroendet av biosensorkomponenternas biologiska tillgänglighet och funktion genom att amplifiera ett genbibliotek via rolling circle amplification (RCA), följt av cellfritt uttryck i ett E. coli-system och direkt jämförande analys av switchegenskaper med nitrocefin. Även om detta cellfria tillvägagångssätt utgör ett värdefullt alternativ till in vivo-metoder, krävs ytterligare optimering för att förbättra RCA-utbytet och analysens prestanda. Slutsatsen är att detta projekt levererar en skalbar och modulär plattform för snabb utveckling och optimering av proteinbiosensorer. Framtida insatser kommer att fokusera på att förfina systemet för att förbättra repeterbarheten, minska bakgrundsbruset och bredda dess tillämplighet till ett bredare spektrum av ligander. Med fortsatta förbättringar har denna plattform potential att påskynda upptäckten och finjusteringen av högpresterande biosensorer, vilket leder till bredare tillämpningar inom bioteknik och syntetisk biologi.