Development of Affinity Ligands Towards ɑHelper Fusion Protein

Sammanfattning

Bioprocessindustrin förlitar sig i hög grad på affinitetskromatografi för effektiv rening, vid sidan av avancerade analyser för screening med hög genomströmning av terapeutiska proteiner. Cytivautvecklade αHelper-fusionsproteinet kombinerar ett standardiserat målprotein med en pålitlig kopplingstagg, vilket gör det mycket effektivt för dessa screeningarbetsflöden. Befintliga anti-αHelper-affinitetsligander uppvisar dock betydande begränsningar, främst genom en suboptimal bindningskinetik med snabba dissociationshastigheter eller dålig alkalisk stabilitet. Dessa nackdelar leder till otillräcklig retention av målet under screening eller strukturell nedbrytning under rigorösa CIP-procedurer (Cleaning-in-Place) som involverar natriumhydroxid, vilket äventyrar både screeningens tillförlitlighet och den operationella livslängden. Denna examensarbete syftar till att konstruera, identifiera och karaktärisera nya anti-ɑHelper-affinitetsligander med förbättrad affinitet, hög selektivitet och robust alkalisk tolerans för hållbara arbetsflöden. För att nå detta mål användes kombinatorisk proteinteknik och in vitro-fagdisplayteknik, vilket undviker djurbaserad immunisering i enlighet med de etiska 3R-principerna. Tre matureringsbibliotek utnyttjades: Bibliotek 1 baserat på ett beta-flak-ramverk (beta-sheet), samt Bibliotek 2 och 3 baserade på en stabilare alfahelixstruktur (ɑ-helical). Iterativa selektionscykler,strängare tvättprotokoll och konkurrens för hämmande av dissociationshastighet (off-rate) gav selektion av de starkaste bindarna. Efter isolering av enskilda kloner visade högkapacitetsscreening med Surface Plasmon Resonance (SPR) en stark korrelation mellan ligandens struktur och dess kemiska motståndskraft. Varianter från betaflak-biblioteket förlorade snabbt sin stabilitet vid alkalisk exponering. I skarp kontrast visade kandidater från de alfa-helikala biblioteken en anmärkningsvärd resistens mot upprepad strukturell stress. Klon L2-09 från Bibliotek 2 framträdde som den främsta kandidaten med exceptionell bindningsaffinitet, hög målselektivitet och extremt långsam dissociationshastighet. L2-09 behöll över 70 % av sin bindningsstabilitet även efter 30 cykler av exponering för 0,3 M natriumhydroxid. En avslutande proof-of-principle-sandwichassay bekräftade att de nya alfahelix-baserade liganderna effektivt fångar in ɑHelper-fuserade målmolekyler utan steriska hinder, vilket säkerställer exakt nedströms kinetisk profilering. Upptäckten av dessa hållbara ligandvarianter löser en kritisk flaskhals inom bioteknisk ligandutveckling genom att avsevärt förlänga fångstmatrisens funktionella livslängd. Genom att integrera hög kemisk stabilitet med pålitlig bindningsprestanda förbättrar dessa anti-ɑHelper-ligander direkt reproducerbarheten och hållbarheten hos analytiska plattformar för framtida bioprocesstillämpningar.