Stabilizing Fab fragments for epitope determination using cryo-EM

Sammanfattning

Epitopkartläggning är en viktig del i utvecklingen av biologiska läkemedel. De flesta sjukdomsorsakande proteinerna i människokroppen är små molekyler mindre än 50 kDa. Senare års utveckling av kryo-EM har möjliggjort strukturbestämmelse av globulära proteiner mindre än 100 kDa. Det är fortfarande väldigt utmanande att bestämma epitopen/paratopen i ett Fab-antigen komplex genom kryo-EM när Fab fragmentet är 50 kDa och målproteinet är mindre än 50 kDa. Målet med denna studie var att producera Rigida-Fab fragment i komplex med antigen som har en molekylvikt under 50 kDa. Rigida-Fab fragment underlättar bildprocesseringen i kryo-EM, vilket kan förbättra elektrondensitetskartorna tillräckligt för att epitop-bestämmelse ska vara möjligt. De Rigida-Fab fragmenten producerades med riktad mutagenes på tre olika Fab fragment, där vissa aminosyror substituerades mot cysteiner för att bilda två (2DS) eller fyra (4DS) interna disulfidbindingar. Proteinerna uttrycktes i mammalieceller och renades med hjälp av protein A. Kvalitén av de Rigida-Fab fragmenten bestämdes genom mätning av den termiska stabiliteten med nanoDSF, analytisk SEC och mätning av affiniteten med SPR. Efter kvalitetsgranskningen bildades komplexen och analyserades med analytisk SEC innan de skickades till SciLifeLab kryo-EM facilitet. Kvalitetsgranskningen konkluderade att de Rigida-Fab fragmenten var producerade som monomerer utan signifikant försämring av affinitet eller stabilitet jämfört med vildtyps Fab fragmenten. Komplexen bildades med 2DS Rigid-Fab fragment och elueringstopparna från analytisk SEC tydde på att komplexbildningen var lyckad. Resultaten visar på framgångsrik produktion av Rigida-Fab fragment till två olika antigener utan funktionsförlust, samt bildandet av Rigid-Fab-antigen komplex som kunde skickas till kryo-EM faciliteten.