Development of an oligonucleotide mediated high sensitivity multiplex assay for biomarker quantification

Sammanfattning

Duchennes muskeldystrofi (DMD) är en sällsynt neuromuskulär sjukdom där patienterna upplever en gradvis tilltagande muskelsvaghet, förlust av gångförmåga samt andnings- och hjärtkomplikationer som är den främsta dödsorsaken. Övervakning av sjukdomsprogression är fortfarande utmanande, eftersom de kliniska bedömningar och biomarkörer som används idag har flera begränsningar gällande sensitivitet, specificitet och invasivitet. Utvecklingen av minimalt invasiva multiplexa biomarköranalyser, som möjliggör kvantifiering av flera cirkulerande proteiner från små provvolymer, skulle därför kunna förbättra monitoreringen av sjukdomsprogression vid DMD. Syftet med detta projekt var att utveckla och utvärdera en högkänslig multiplex biomarkörpanel för DMD med hjälp av suspension bead array (SBA)-teknologi i kombination med BOLD-signalförstärkning. Kandidatbiomarkörer identifierades genom analys med linjära mixed-effects modeller av tidigare genererade Luminex-data från FOR-DMD och CINRG-DNHS kohorterna. Baserat på associationer med fysiska tester valdes CAPNS1, DLD och ATP5PF ut för vidare assayutveckling. Antikroppar kopplades till magnetiska kulor och utvärderades först med single-binder SBA-assays, följt av utveckling av sandwich SBA-assays genom att testa olika kombinationer av infångningsantikroppar och detektionsantikroppar. Funktionella sandwich-assays utvecklades för ATP5PF, DLD och CAPNS1, vilka därefter utvärderades med BOLD-SBA assays. För ATP5PF resulterade BOLD-signalförstärkning i ökade signalintensiteter och förbättrad assaykänslighet efter optimering av detektionsantikroppens koncentration. För DLD ökade BOLD signalintensiteten jämfört med standard-SBA, men koncentrationsberoende detektion kunde inte uppnås. CAPNS1 gav inga detekterbara målspecifika signaler under BOLD-förhållanden. Utvärdering av multiplexformat visade att ATP5PF och TTN kunde analyseras samtidigt utan någon större försämring av assayprestanda, medan inkludering av DLD påverkade assayprestandan negativt i multiplexformat.