Optimering av ddPCR och jämförelse av analytisk sensitivitet med realtids-PCR för detektion av Borrelia burgdorferi sensu lato

Sammanfattning

Neuroborrelios diagnostiseras i första hand med serologi, men metoden har låg sensitivitet i ett tidigt skede då antikroppar ännu inte utvecklats. Realtids-PCR används som komplement, men begränsas av låg bakteriehalt i cerebrospinalvätska . En alternativ metod är droplet digital PCR (ddPCR), som möjliggör absolut kvantifiering och kan ge högre känslighet vid låga koncentrationer. Syftet med denna studie var att optimera ddPCR samt jämföra dess analytiska sensitivitet med realtids-PCR för detektion av Borrelia burgdorferi sensu lato. Optimeringen omfattade fastställande av annealing-temperatur och utvärdering av restriktionsenzym. En temperatur på 60 °C gav bäst separation mellan positiva och negativa droppar. Tillsatt restriktionsenzym visade däremot sämre droppseparation. För att jämföra metodernas sensitivitet analyserades en spädningsserie med B. garinii Lu59 med cDNA som mall och en syntetisk tillverkad DNA-kontroll. Båda metoder kunde detektera ned till 100 celler/mL i den biologiska serien och 2 molekyler/µL i den syntetiska. ddPCR och realtids-PCR uppvisade därmed likvärdig analytisk sensitivitet inom ramen för studiens upplägg. För att stärka resultatens tillförlitlighet och möjligheten att generalisera krävs ytterligare optimering och fler replikat.