Optimering av protokoll till flödescytometri : Kvantifiering av bakteriofager med dubbel- och enkelsträngat DNA

Sammanfattning

Bakteriofager (fager) är virus som infekterar bakterier och kvantifiering är aktuellt både inom klinisk verksamhet, såsom vid fagterapi samt miljöforskning kring övergödning i havet och global uppvärmning. SYBR Gold kan möjliggöra detektion av fager vid metoder som flödescytometri (FC) och epifluorescensmikroskopi (EFM), som kvantifierar totalantalet fager. Plackanalys (PA) kvantifierar fager som lyserar bakterier och är tidskrävande. Syftet var att optimera ett flödescytometriprotokoll för förbättrad fagkvantifiering samt undersöka linjäriteten vid FC. Fagstamlösningar bereddes genom att odla dem med respektive värdbakterie och därefter skörda lyserade agarplattor. Olika protokoll för FC testades med målet att förbättra fagkvantifieringen. Det protokoll som gav bäst resultat jämfördes med referensmetoderna PA och EFM. Resultatet visade att standardprotokollet (SYBR i ultrarent H2O) jämfört med ett nytt protokoll (SYBR Gold i TE-buffert) gav högre förklaringsgrad vid regressionsanalys, samt lägre variationskoefficient (CV%), händelser per sekund och bortsorteringsfrekvens. Resultatet visade ett linjärt samband mellan relativ koncentration och antalet händelser i proven hos de flesta fagerna. En statistisk jämförelse mellan metoderna visde att det fanns signifikant skillnad mellan metodernas kvantifieringsförmåga i flera fall. FC kvantifierade fler fager än båda referensmetoderna och hade lägre CV än PA i flera fall. FC underskattade antalet fager som var enkelsträngade och hade modifierat guanin, vilka är sämre på att binda färg. Sammanfattningsvis har optimeringen av protokollet inte lyckats kvantifiera svårfärgade fager eftersom FC underskattar antalet och linjärt samband saknas för en av dem. FC har däremot visat sig fungera lika bra eller bättre än EFM i flera fall vad gäller fager med dubbelsträngat DNA.