Optimization of a Digestion Protocol for Proteomic Profiling of Low Cell Number FACS-Sorted Cells

Sammanfattning

Utvecklingen av känsliga proteomikplattformar har revolutionerat vår förmåga att analysera proteiner i små provmängder och därmed möta utmaningar inom klinisk och biologisk forskning. Denna avhandling presenterar optimeringen av ett proteomiskt arbetsflöde skräddarsytt för paucicellulära system genom att undersöka proteomet hos immuncellpopulationer i olika differentieringsstadier, med fokus på erytroid-, monocyt- och T-celler. Med hjälp av Evotips™ för minskad provförlust och Evosep One LC kopplad till timsTOF SCP masspektrometer analyserade vi framgångsrikt prover med lågt cellantal, från 100 till 1000 celler. Vi strävade efter att förbättra digestionseffektiviteten genom optimering av nyckelparametrar, inklusive inkubationstid, buffertkoncentration, enzym-till-substrat-förhållande, samtidigt som vi också övervägde ytterligare förhållanden som ultraljudsbehandling och införandet av acetonitril i digestionsbufferten. De optimerade förhållandena ledde till förbättringar av peptid- och proteinidentifieringarna och en betydande minskning av andelen peptider med missade klyvningar, vilket förde protokollet närmare standarderna för proteomik i bulk. Som en validering av det optimerade arbetsflödet identifierades kända proteinmarkörer framgångsrikt i erytroid-, monocyt- och CD8+ T-cellpopulationerna. Dessa resultat bekräftar metodens förmåga att upptäcka relevanta proteomiska markörer och visar dess potential för framtida studier som involverar dyrbara eller begränsade kliniska prover. Detta arbete visar robustheten i det optimerade tillvägagångssättet, vilket banar väg för bredare tillämpningar inom upptäckt av biomarkörer och cancerforskning.